دوره 27، شماره 1 - ( دو ماهنامه طب جنوب 1403 )
جلد 27 شماره 1 صفحات 52-37 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Sobhanparast S, Soleymani J, Aftabi Y, Chaparzadeh N. Optimizing DNA Extraction from Frozen Blood Samples for Studying Telomere Length. Iran South Med J 2024; 27 (1) :37-52
URL: http://ismj.bpums.ac.ir/article-1-1984-fa.html
URL: http://ismj.bpums.ac.ir/article-1-1984-fa.html
سبحان‌پرست ساجده، سلیمانی جعفر، آفتابی یونس، چاپارزاده نادر. بهینه‌سازی استخراج DNA برای مطالعه طول تلومر از نمونه‌های خون منجمد. مجله طب جنوب. 1403; 27 (1) :37-52
ساجده سبحان‌پرست1 
، جعفر سلیمانی2 ، یونس آفتابی3 ، نادر چاپارزاده*4
، جعفر سلیمانی2 ، یونس آفتابی3 ، نادر چاپارزاده*4
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
مرکز تحقیقات سل و بیماری‌های ریه، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
2- مرکز تحقیقات آنالیز دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
3- مرکز تحقیقات سل و بیماری‌های ریه، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
4- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران ،Nchapar@azaruniv.ac.ir
مرکز تحقیقات سل و بیماری‌های ریه، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
2- مرکز تحقیقات آنالیز دارویی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
3- مرکز تحقیقات سل و بیماری‌های ریه، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران
4- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران ،
چکیده: (772 مشاهده)
زمینه: بهینه‌سازی استخراج DNA در راستای حفظ طول تلومر به‌عنوان زیست‌نشانگر پیری و انواع بیماری‌ها بسیار مهم است. نمونه‌های خونی که به‌طور طولانی مدت نگهداری شده‌اند، منبع بسیار مهمی برای مطالعات ژنتیکی محسوب می‌شوند. در این مطالعه با استفاده از بافرهای لیز مختلف به همراه بافر استخراج CTAB، کیفیت DNA استخراجی و اثر بازدارنده‌های همراه آن بر روی PCR کمی در مطالعات تلومر بررسی شد.
مواد و روش‌ها: استخراج DNA با ۶ بافر لیزکننده گلبول قرمز و بافر استخراج بر پایه CTAB، انجام شد. یکپارچگی DNA با ژل الکتروفورز، کمّیت با جذب در ۲۶۰ نانومتر و خلوص آن با مقادیر مورد انتظار ۸/۱ و ۲/۲-۲ برای نسبت‌های ۲۸۰A/۲۶۰A و ۲۳۰A/۲۶۰A ارزیابی گردید. ارزیابی کمّی اثر هر بافر در واکنش q-PCR و تکرارپذیری نتایج به ترتیب با محاسبه بازده واکنش، ضریب تعیین (R2) و درصد ضریب تغییرات (%CV) محاسبه شد.
یافته‌ها: بیش‌ترین مقدار DNA استخراج شده (324/93 نانوگرم بر میلی‌لیتر، 11/53CV%:) با استفاده از بافر ۵ (۱۰ میلی‌مولار Tris-HCL ۶/۷pH=، ۵۰ میلی‌مولار NaCl) به‌دست آمد. تمامی بافرها مقادیر مطلوب برای ۲۸۰A/۲۶۰A و ۲۳۰A/۲۶۰A داشتند و از نظر خلوص DNA تفاوتی (0/05p>) نداشتند. طبق نتایج ژل، DNA استخراج شده همه بافرها به جز یکی، فاقد خردشدگی بود. مولکول DNA استخراج شده با بافر ۱ (NH4Cl ۱۵۵میلی‌مولار، KHCO3 ۱۰ میلی‌مولار و EDTA ۵ میلی‌مولار) بهترین عملکرد را در واکنش q-PCR برای ژن HBG (0/126=E و 0/97=R2) و تلومر (0/99= بازده، 0/99=R2) داشت.
نتیجه‌گیری: مولکول DNA استخراج شده با بافر ۱ از نمونه خون منجمد جهت مطالعه تلومر کم‌ترین بازدارندگی q-PCR را نشان داد.
مواد و روش‌ها: استخراج DNA با ۶ بافر لیزکننده گلبول قرمز و بافر استخراج بر پایه CTAB، انجام شد. یکپارچگی DNA با ژل الکتروفورز، کمّیت با جذب در ۲۶۰ نانومتر و خلوص آن با مقادیر مورد انتظار ۸/۱ و ۲/۲-۲ برای نسبت‌های ۲۸۰A/۲۶۰A و ۲۳۰A/۲۶۰A ارزیابی گردید. ارزیابی کمّی اثر هر بافر در واکنش q-PCR و تکرارپذیری نتایج به ترتیب با محاسبه بازده واکنش، ضریب تعیین (R2) و درصد ضریب تغییرات (%CV) محاسبه شد.
یافته‌ها: بیش‌ترین مقدار DNA استخراج شده (324/93 نانوگرم بر میلی‌لیتر، 11/53CV%:) با استفاده از بافر ۵ (۱۰ میلی‌مولار Tris-HCL ۶/۷pH=، ۵۰ میلی‌مولار NaCl) به‌دست آمد. تمامی بافرها مقادیر مطلوب برای ۲۸۰A/۲۶۰A و ۲۳۰A/۲۶۰A داشتند و از نظر خلوص DNA تفاوتی (0/05p>) نداشتند. طبق نتایج ژل، DNA استخراج شده همه بافرها به جز یکی، فاقد خردشدگی بود. مولکول DNA استخراج شده با بافر ۱ (NH4Cl ۱۵۵میلی‌مولار، KHCO3 ۱۰ میلی‌مولار و EDTA ۵ میلی‌مولار) بهترین عملکرد را در واکنش q-PCR برای ژن HBG (0/126=E و 0/97=R2) و تلومر (0/99= بازده، 0/99=R2) داشت.
نتیجه‌گیری: مولکول DNA استخراج شده با بافر ۱ از نمونه خون منجمد جهت مطالعه تلومر کم‌ترین بازدارندگی q-PCR را نشان داد.
فهرست منابع
1. Shammas MA. Telomeres, lifestyle, cancer, and aging. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2011; 14(1): 28–34. [DOI]
2. Denham J, Marques FZ, Charchar FJ. Leukocyte telomere length variation due to DNA extraction method. BMC Res Notes 2014; 7: 877. [DOI]
3. Di Pietro F, Ortenzi F, Tilio M, et al. Genomic DNA extraction from whole blood stored from 15- to 30-years at -20 °C by rapid phenol-chloroform protocol: A useful tool for genetic epidemiology studies. Mol Cell Probes 2011; 25(1): 44–8. [DOI]
4. Lin J, Smith DL, Esteves K, et al. Telomere length measurement by qPCR – Summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology 2019; 99: 271–8. [DOI]
5. Goldberg S. Mechanical/physical methods of cell distribution and tissue homogenization. Methods Mol Biol 2014; 1295: 1–20. [DOI]
6. Posch A. Sample preparation guidelines for two-dimensional electrophoresis. Arch Physiol Biochem 2014; 120(5): 192–197. [DOI]
7. Akane A, Matsubara K, Nakamura H, et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J Forensic Sci1994;39(2):362–372. [DOI]
8. de Franchis R, Cross NCP, Foulkes NS, et al. A potent inhibitor of Taq polymerase copurifies with human genomic DNA. Nucleic Acids Res 1988; 16(21): 10355. [DOI]
9. Sidstedt M, Hedman J, Romsos EL, et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Anal Bioanal Chem 2018; 410(10): 2569–2583. [DOI]
10. Lucena-Aguilar G, Sánchez-López AM, BarberánAceituno C, et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreserv Biobank 2016; 14(4): 264–270. [DOI]
11. Boardman LA, Skinner HG, Litzelman K. elomere length varies by DNA extraction method: Implications for epidemiologic research - Response. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2014; 23(6): 1131. [DOI]
12. Cunningham JM, Johnson RA, Litzelman K, et al. Telomere length varies by DNA extraction method: Implications for epidemiologic research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2013; 22(11): 2047–2054. [DOI]
13. Martin-Ruiz CM, Baird D, Roger L, et al. Reproducibility of telomere length assessment: An international collaborative study. Int J Epidemiol 2015; 44(5): 1749–1754. [DOI]
14. Joglekar MV, Satoor SN, Wong WKM, et al. An optimised step-by-step protocol for measuring relative telomere length. Methods Protoc 2020; 3(2): 27. [DOI]
15. Cawthon RM. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res 2002; 30(10): e47. [DOI]
16. Guha P, Das A, Dutta S, et al. A rapid and efficient DNA extraction protocol from fresh and frozen human blood samples. J Clin Lab Anal 2018; 32(1): e22181. [DOI]
17. Chacon-Cortes D, Haupt LM, Lea RA, et al. Comparison of genomic DNA extraction techniques from whole blood samples: A time, cost and quality evaluation study. Mol Biol Rep 2012; 39(5): 5961–5966. [DOI]
18. Brown WE, Hu JC, Athanasiou KA. Ammonium-chloride-potassium lysing buffer treatment of fully differentiated cells increases cell purity and resulting neotissue functional properties. Tissue Eng - Part C Methods 2016; 22(9): 895–903. [DOI]
19. Galyuk EN, Lando DY, Egorova VP, et al. Na2CO3 influence on DNA double helix stability: Strong anion destabilizing effect. J Biomol Struct Dyn 2003; 20(6): 801–809. [DOI]
20. Borges A, Rosa MS, Recchia GH, et al. CTAB methods for DNA extraction of sweetpotato for microsatellite analysis. Sci Agric 2009; 66(4): 529–534. [DOI]
21. Song Y, Fahs A, Feldman C, et al. A reliable and effective method of DNA isolation from old human blood paper cards. Springerplus 2013; 2: 616. [DOI]
22. Terry CF, Harris N, Parkes HC. Detection of genetically modified crops and their derivatives: Critical steps in sample preparation and extraction. J AOAC Int. 2002; 85(3): 768–774. [DOI]
23. Budelier K, Schorr J. Purification of DNA by Anion‐ Exchange Chromatography. Curr Protoc Mol Biol 2001: Chapter 2: Unit2. 1B. [DOI]
24. Carpi FM, Di Pietro F, Vincenzetti S, et al. Human DNA extraction methods: Patents and applications. Recent Patents DNA Gene Seq 2011; 5(1): 1–7. [DOI]
25. Demeke T, Jenkins GR. Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits. Anal Bioanal Chem 2010; 396(6): 1977–1990. [DOI]
26. Thomas JC, Khoury R, Neeley CK, et al. A fast CTAB method of human DNA isolation for polymerase chain reaction Applications. Biochem Educ 1997; 25(4): 233–235. [DOI]
27. Shokrzadeh M, Mohammadpour A. Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharm Biomed Res 2018; 4(2): 28–32. [DOI]
28. Ebadi Z, Ghaffarian S. Association of WDR79 (rs2287497C>T) Poly-morphism with Breast Cancer Susceptibility in Northwest of Iran. Iran South Med J 2023; 26(1): 1-13. [DOI]
29. Aronhime S, Calcagno C, Jajamovich GH, et al. DCEMRI of the liver: Effect of linear and nonlinear conversions on hepatic perfusion quantification and reproducibility. J Magn Reson Imaging 2014; 40(1): 90–8. [DOI]
30. Liu P, Zhu Z, Zeng C, et al. Specific absorption spectra of hemoglobin at different PO2 levels: potential noninvasive method to detect PO2 in tissues. J Biomed Opt 2012; 17(12): 125002. [DOI]
31. Al-Soud WA, Rådström P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J Clin Microbiol 2001; 39(2): 485–493. [DOI]
32. Zhou L, Lei Q, Guo J, et al. Long-term whole blood DNA preservation by cost-efficient cryosilicification. Nat Commun 2022; 13: 6265. [DOI]
33. Kuffel A, Gray A, Daeid NN. Impact of metal ions on PCR inhibition and RT-PCR efficiency. Int J Legal Med 2021; 135(1): 63–72. [DOI]
34. Heikrujam J, Kishor R, Behari Mazumder P. the chemistry behind plant dna isolation protocols. In: Boldura OM, Baltă C, Awwad NS eds. Biochemical analysis tools - Methods for bio-molecules studies. IntechOpen, 2020. [DOI]
35. Lahiri DK, Schnabel B. DNA isolation by a rapid method from human blood samples: Effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality. Biochem Genet 1993; 31(7): 321–328. [DOI]
36. Opel KL, Chung D, McCord BR. A study of PCR inhibition mechanisms using real time PCR. J Forensic Sci 2010; 55(1): 25–33. [DOI]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
