دانشگاه علوم پزشکی بوشهر

زمینه: نبود کنترل داخلی در پژوهش‌های انجام گرفته در زمینه PCR‌های تشخیصی محدودیتی مهم محسوب می‌گردد. به‌کارگیری تکنیک‌های آزمایشگاهی حساس و اختصاصی همچون PCR در تشخیص کریپتوکوکوزیس، ضروری است. روش‌های متنوعی برای تشخیص این قارچ بیماری‌زا وجود دارد. به‌طورکلی روش‌های مبتنی بر کشت، تکنیک‌های وقت‌گیر با حساسیت پایین هستند و نیازمند امکانات و تجربه کافی برای تفسیر نتایج می‌باشند و همچنین روش‌های رنگ‌آمیزی نیزحساسیت لازم را ندارند. در نتیجه روش‌های مولکولی از جمله PCR، تکنیک‌های مناسب‌تری برای شناسایی هستند. هدف این مطالعه طراحی و ساخت کنترل داخلی تکثیری پلاسمیدی (IAC) جهت شناسایی ممانعت کننده‌ها در آزمایش PCR کریپتوکوکوس نئوفورمنس (C.neo) و کاربردهای آتی در لابراتوارهای روتین تشخیصی بوده است. مواد و روش‌ها: در این بررسی برای ساخت کنترل داخلی، ابتدا پرایمرهای ویژه آزمایش PCR، بر مبنای هدف ژنی 16S rRNA جهت تشخیص مولکولی، بهینه و سپس حساسیت و ویژگی مشخص شد. پرایمرهای مرکب (Composite Primer) برای IAC-C.neo نیز طراحی، تکثیر و سپس کلون گردید. IAC-C.neo تکثیر شده در پلاسمید pTZ57R الحاق و در باکتری اشریشیا کلی JM107 ترانسفورم و کلون گردید. تعداد حداقل IC در هر واکنش PCR با رقیق‌سازی و همچنین طیف پاسخ PCR همراه با IC مورد بررسی قرار گرفت یافته‌ها: اندازه محصول تشخیصی C.neo با پرایمرهای اختصاصی آن برابر با bp 415 و محصول IAC-C.neo برابر با 661 جفت باز بود، که از نظر اندازه، اختلاف مطلوب (246 جفت باز) را با هم دارند. تعداد حداقل IC در هر واکنش 1000 عدد تعیین شد. حداقل و حداکثر حساسیت آزمایش PCR همراه با IC برای DNA کریپتوکوکوس نئوفورمنس بین 3 میلیون تا 100 عدد کریپتوکوکوس مشخص گردید. در آزمایش ویژگی با عوامل مختلف هیچ محصول ناخواسته‌ای مشاهده نشد. نتیجه‌گیری: علیرغم سرعت و دقت بالای تکنیک PCR، یافته‌های منفی و مثبت کاذب که به‌دلایل مختلف رخ می‌دهند از مشکلات مهم این تکنیک جذاب می‌باشد که می‌توانند کارایی آن را کاهش دهند. استفاده از یک کنترل داخلی در تشخیص مولکولی کریپتوکوکوس نئوفورمنس، این خطاها را شناسایی می‌نماید.