fa بیان و تخلیص دو پروتئین نوترکیب DnaK و Omp31 بروسلا ملی تنسیس و جداسازی اندوتوکسین همراه آن‌ها عمومى General پژوهشي Original <p>زمینه: امروزه به‌دلیل مشکلاتی که سوش واکسن بروسلا ملی تنسیس ایجاد می‌کند، توسعه واکسن ساب یونیتی با استفاده از پروتئین‌های نوترکیب مد نظر است. علی‌رغم به‌دست آمدن پروتئین‌های نوترکیب با بیش‌تر از 95 درصد خلوص، این پروتئین‌ها هنوز حاوی میزان زیاد و مشخصی از اندوتوکسین هستند. اندوتوکسین‌ها، لیپوپلی‌ساکاریدهایی همراه با غشاء بیرونی باکتری‌های گرم منفی هستند. سمیت ذاتی این لیپوپلی ساکاریدها دارای یک اثری شاخص بر روی رخدادهای بیوشیمیایی بعضی از سلول‌ها از جمله سلول‌های ایمنی هستند و می&lrm;توانند در آزمایش‌های انجام شده در شرایط آزمایشگاه تداخل ایجاد کنند. مواد و روش‌ها: پلاسمیدهای بیانی حاوی دوژن dnakوomp31 به‌درون باکتری (DE3)E.coli Bl21 ترانسفورم شد. بعد پس از انتخاب کلونی مناسب با استفاده از روش وسترن بلات محلولیت و عدم محلولیت هر کدام معین شد. سپس بعد از بیان در 20 درجه به‌مدت 22 ساعت با استفاده از روش Ni-NTA آگاروز و روش تخلیص با استفاده از اوره، پروتئین‌های نوترکیب تخلیص گردید. در هنگام شستشو Ni-NTA agarose هم از روش همراه با دترجنت Triton X-114 و هم بدون آن (استاندارد) استفاده شد. یافته‌ها: در این مطالعه میزان 20 و 8 میلی‌گرم از پروتئین‌های نوترکیب DnaK و Omp31 به‌ترتیب با استفاده از روش استاندارد به‌دست آمد در حالی‌که در روشی که دترجنت استفاده شده بود، این میزان 20 درصد افت داشت. اما در عوض میزان اندوتوکسین در محصول نهایی به‌میزان بسیار زیادی جدا شده بود و به کمتر از EU 05/0 میلی‌گرم در لیتر رسید. نتیجه‌گیری: روش به‌کار رفته در این مطالعه می‌تواند به‌عنوان روشی مناسب به‌منظور بیان، تخلیص و جدا سازی از محصول پروتئین نوترکیب نهایی برای تمام پروتئین‌های با خصوصیات فیزیولوژیکی مشابه به‌کار رود.</p> <p>Background: New strategies are needed to protect against Brucella melitensis infection. Subunit vaccines offer a promising approach because they can stimulate both cellular and humoral immunity, so high production of recombinant protein with less content of endotoxin is desired. In present study, we described a method for expression and purification of B.melitensis recombinant DnaK(rDnaK) and Omp31(rOmp31) proteins while less content of endotoxins were detected in final product. Material and Methods: Recombinant pET-dnak and pDEST-omp31 plasmids were transformed into competent expression host E.coli BL21 (DE3). After induction by IPTG, bacteria were grown at 20◦C for 22h. Then recombinant proteins were purified by Ni-NTA Agarose. Purification was done while two methods using Triton X-114 in washing steps and standard protocol (without detergent) were used in parallel. Results: rDnak and rOmp31 were purified by using Urea. We could obtain 20 and 8 mg recombinant proteins from rDnak and rOmp31 from 1 liter medium, respectively. The amount of endotoxins in final products was less content of 0.05 EU/mg. Furthermore, recovery of protein was up to 80% as compared to the standard protocol. Conclusion: The method used in this study, gives a product with very low extent of endotoxin, but 20% of recombinant proteins were lost. So we think the method described here can be used for purification and endotoxin removal of other recombinant proteins with similar physiologic properties.</p> پروتئین نوترکیب, تخلیص, اندوتوکسین, بیان recombinant protein, purification, endotoxin, expression 516 523 http://ismj.bpums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3-483&slc_lang=fa&sid=1 Amir Ghasemi امیر قاسمی 570031947532846008781 570031947532846008781 No Department of Pathobiology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, IRAN گروه پاتوبیولوژی، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران Mohammed Hussain Salari محمدحسین سالاری mhsalari2002@gmail.com 570031947532846008782 570031947532846008782 Yes Department of Pathobiology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, IRAN گروه پاتوبیولوژی، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران Amir Hassan Zarnani امیر حسن زرنانی 570031947532846008783 570031947532846008783 No Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, IRAN<br>Immunology Research Center, Iran University of Medical Sciences, Tehran, IRAN پژوهشکده نانوتکنولوژی، پژوهشگاه فناوری‌های نوین ابن‌سینا، جهاد دانشگاهی تهران<br>مرکز تحقیقات ایمونولوژی، دانشگاه علوم پزشکی ایران Mahmoud Jeddi-Tehrani محمود جدی‌تهرانی 570031947532846008784 570031947532846008784 No Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, IRAN پژوهشکده مونوکلونال آنتی‌بادی، پژوهشگاه فناوری‌های نوین ابن‌سینا، جهاد دانشگاهی تهران