fa بررسی بیان مینی ژن‌های فاکتور 9 انسانی در سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان عمومى General پژوهشي Original <p>زمینه:سلول‌های بنیادی مزانشیمی هدف مناسبی جهت سلول درمانی و ژن درمانی بیماران هموفیلی B محسوب می‌شوند. این سلول‌ها دارای ویژگی‌های بی‌نظیر از جمله تمایز به طیف وسیعی از سلول‌های مختلف و ایمنی‌زایی اندک در شرایط پیوند می‌باشند که آن‌ها را برای سلول درمانی و ژن درمانی مناسب کرده است. بیان اندک ترانس ژن از مشکلات ژن درمانی است. با شناسایی توالی‌های تنظیمی و استفاده از آن‌ها در موقعیت‌های مناسب در ناقلین می‌توان در جهت بهبود بیان ژن با هدف ژن درمانی اقدام نمود. در این بررسی، 4 ناقل پلاسمیدی فاکتور 9 فاقد و واجد اینترون‌های ژن بتاگلوبین به درون سلول‌های مزانشیمی ترانسفکت گردیدند. هدف این پژوهش بررسی توانایی این سلول‌ها در بیان فاکتور 9 بود. مواد و روش‌ها: پس از جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از استخوان تیبیا و فمور موش رت، فنوتیپ این سلول‌ها با روش فلوسایتومتری تعیین شد. ناقلین پلاسمیدی فاکتور 9 با استفاده از عامل ترانسفکشن به درون سلول‌های مزانشیمی وارد شدند. 48 ساعت پس از ترانسفکشن، توانایی سلول‌های بنیادی در بیان مینی ژن‌های مختلف فاکتور 9 از طریق انجام آزمون ساندویچ الایزا بر روی محیط کشت و آزمون RT-PCR ارزیابی شد. برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم‌افزار SPSS ویرایش 18 استفاده شد. مقایسه میانگین داده‌ها با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه (One &ndash; Way ANOVA) انجام شد. یافته‌ها:بالاترین سطح بیان فاکتور 9 از سازه ژنی بدون اینترون و سازه ژنی دارای اینترون 1 ژن بتاگلوبین به‌دست آمد.بالاترین میزان فعالیت زیستی از فاکتور9 ترشح شده به محیط کشت از سازه ژنی دارای اینترون 1 و 2 بتا گلوبین به‌دست آمد. نتیجه‌گیری:سلول‌های بنیادی مزانشیمی توانائی بیان فاکتور 9 و اسپلایسنگ اینترون 1 ژن بتاگلوبین را نشان دادند. توالی‌های اینترونی بتاگلوبین سطح بیان فاکتور 9 را کاهش دادند که این کاهش بیان را می‌توان با احتمال به اسپلایسینگ نادرست اینترون‌ها نسبت داد.</p> <p>Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) are appropriate target for gene and cell-based therapy of hemophilia B patients. MSCs possess several unique properties such as capability of differentiating into multiple lineages and lower immunogenecity in transplant procedure that make them attractive candidates for cell and gene therapy. One of the challenges in the gene therapy is the low expression level of transgene. To improve expression, strong regulatory elements in the context of vectors could contribute to improve efficacy of gene therapy strategies. In this study four human factor IX (hFIX)-expressing plasmids equipped with various combination of human -globin (hBG) introns and Kozak sequence were transfected into the MSCs and expression of the hFIX was evaluated in vitro. Material and Methods: MSCs were obtained from tibias and the femora of rats and phenotypic characterization of the MSCs was determined by flow cytometry. Four hFIX-expressing plasmids were introduced into the culture-expanded MSCs using transfection agent. 48 hours after transfection, ability of the MSCs for expression of the hFIX and efficacies of the plasmids were evaluated by performing sandwich ELISA on cultured media as well as semi-quantitative RT-PCR. All analyses were performed with One-way ANOVA using SPSS software. Results:The highest expression level of the hFIX was obtained from intron-less and hBG intron-I containing construct. The highest biological activity was obtained from hBG intron-I,II containing construct. Conclusion:Successful expression of the hFIX was obtained from recombinant MSCs. MSCs were able to splice heterologous hBG intron-I from the hFIX-cDNA. Application of thehBG introns reduced the hFIX expression levels, probably due to improper splicing of the hBG introns.</p> سلول‌های بنیادی مزانشیمی, هموفیلی B, فاکتور 9, ناقل پلاسمیدی, اینترون‌های ژن بتاگلوبین mesenchymal stem cells, hemophilia B, human factor IX, plasmid, human β-globin introns 130 140 http://ismj.bpums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3-436&slc_lang=fa&sid=1 Azadehsadat Azadbakhsh آزاده سادات آزادبخش 570031947532846009044 570031947532846009044 No Department of Biology, School of Science, Urmia University, Urmia, IRAN<br>Department of Cellular and Molecular Biotechnology, Institute of Biotechnology, Urmia University, Urmia, IRAN گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه<br>گروه زیست فناوری سلولی و مولکولی، پژوهشکده زیست فناوری، دانشگاه ارومیه Mohammad Reza Sam محمدرضا سام m.sam@urmia.ac.ir 570031947532846009045 570031947532846009045 Yes Department of Biology, School of Science, Urmia University, Urmia, IRAN<br>Department of Cellular and Molecular Biotechnology, Institute of Biotechnology, Urmia University, Urmia, IRAN گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه<br>گروه زیست فناوری سلولی و مولکولی، پژوهشکده زیست فناوری، دانشگاه ارومیه Farah Farrokhi فرح فرخی 570031947532846009046 570031947532846009046 No Department of Biology, School of Science, Urmia University, Urmia, IRAN گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه Alireza Zomorodipour علیرضا زمردی‌پور 570031947532846009047 570031947532846009047 No Department of Molecular Genetics, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, IRAN گروه ‌ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران Ali Akbar Haddad Mashahrizeh علی اکبر حداد مشهد ریزه 570031947532846009048 570031947532846009048 No Department of Biology, School of Science, Ferdowsi University of Mashad, Mashad, IRAN گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد Aram Mokarizadeh آرام مکاری‌زاده 570031947532846009049 570031947532846009049 No Department of Immunology, School of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, IRAN گروه ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه ارومیه