Iranian South Medical Journal
مجله طب جنوب
Iran South Med J
Medical Sciences
http://ismj.bpums.ac.ir
57
journal57
1735-4374
1735-6954
10.52547/ismj
fa
jalali
1396
4
1
gregorian
2017
7
1
20
3
online
1
fulltext
fa
کلونینگ و بررسی بیان ژن flaA هلیکوباکتر پیلوری در سیستم یوکاریوتی
Cloning and Study of Expression of Helicobacter Pylori FlaAGene in Eukaryotic System
بیوشیمی
Biochemistry. Cell Biology and Genetics
پژوهشي
Original
<p dir="RTL" style="margin-right:-2.85pt;text-align:justify;direction:rtl;unicode-bidi:embed;"><strong><u><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:11.0pt;">زمینه: </span></span></span></u></strong><strong><em><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">هلیکوباکتر پیلوری</span></span></span></em></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> شایعترین باکتری است که جوامع انسانی را در ابعاد جهانی مبتلا به عفونت ساخته اس</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">ت. </span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">بیان فلاژل و تحرک باکتری در کلونیزاسیون و ویرولانس آن عامل بسیار مهمی است. ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong> <strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">یکی از ژنهای کد کننده فلاژلین میباشد که نقش کلیدی در حرکت باکتری و کلونیزاسیون آن دارد و از نظر ایمنی بخشی نیز مورد توجه میباشد. هدف از این مطالعه طراحی، ساخت سازواره و بررسی بیان ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> <em>هلیکوباکتر پیلوری </em></span>در سلولهای یوکاریوتی است.</span></span></strong></p>
<p dir="RTL" style="text-align:justify;direction:rtl;unicode-bidi:embed;"><strong><u><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:11.0pt;">موادوروشها: </span></span></span></u></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">در این مطالعه تجربی، ابتدا از <em>هلیکوباکتر پیلوری</em> سویه استاندارد، </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">DNA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> ژنومی تخلیص و ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> با پرایمرهای اختصاصی به روش </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">PCR</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> تکثیر و جداسازی شد. سپس با بهرهگیری از تکنیک همسانه سازی </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">T/A</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> در پلاسمید </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pTZ</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> کلون گردید. به منظور بیان ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> و ایجاد سازواره نهایی، ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> از پلاسمید </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pTZ</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> خارج شد و در وکتور بیانی (-)</span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pcDNA3.1</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> ساب کلون گردید. سازواره </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">-flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">(-)</span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pcDNA3.1</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> به روش الکتروپوریشن به سلول جانوری </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">CHO</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> منتقل و بیان یوکاریوتی ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> با تکنیک </span></span></span></strong><br>
<strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">SDS-PAGE</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> بررسی شد.</span></span></span></strong></p>
<p dir="RTL" style="margin-right:-2.85pt;text-align:justify;direction:rtl;unicode-bidi:embed;"><strong><u><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:11.0pt;">یافتهها: </span></span></span></span></u></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">نتایج نشان میدهد محصول </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">PCR</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> ژن </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> در وکتور </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pTZ</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> کلون و در باکتری اشریشیا کلای سویه </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">TOP10F</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> تکثیر یافته است. همچنین هضم آنزیمی و تعیین توالی حاکی از تشکیل سازواره نهایی </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">-flaA</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">(-)</span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pcDNA3.1</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> است. در نهایت بررسی بیان ژن </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> <em>هلیکوباکتر پیلوری</em></span> در سلول جانوری </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">CHO</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">، نشان داد سازواره ژنی حاصل قادر به بیان موفق محصول ژن </span></span></span></span></strong><strong><span dir="LTR" style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="letter-spacing:-.1pt;"><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> در سیستم یوکاریوتی میباشد.</span></span></span></span></strong></p>
<p dir="RTL" style="margin-right:-2.85pt;text-align:justify;direction:rtl;unicode-bidi:embed;"><strong><u><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:11.0pt;">نتیجهگیری: </span></span></span></u></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">با توجه به اینکه سازواره نهایی </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">-flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">(-)</span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pcDNA3.1</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> قادر به بیان محصول پروتئینی ژن </span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> <em>هلیکوباکتر پیلوری</em></span> در سلولهای جانوری میباشد و پروتئین فلاژلین یکی از آنتی ژنهای مهم این باکتری است. بنابراین به درستی میتوان گفت که سازواره ژنی</span></span></strong><br>
<strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">-flaA</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;">(-)</span></span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:black;"><span style="font-size:9.0pt;">pcDNA3.1</span></span></span></strong><strong><span style="color:black;"><span style="font-family:b lotus;"><span style="font-size:10.0pt;"> کاندیدای مناسبی برای استفاده در زمینه واکسنهای ژنی علیه <em>هلیکوباکتر پیلوری</em> میباشد و در تحقیقات آینده میتوان از آن برای بررسی ایمنی زایی در حیوانات آزمایشگاهی بهره گرفت.</span></span></span></strong></p>
<p style="text-align: justify;"><strong><u>Background</u></strong>: <em>Helicobacter pylori</em> is the most common bacterium causing chronic infections worldwide. Expression of flagella and bacterial motility are essential in colonization and virulence. <em>FlaA gene </em>is one of the <em>flagellin</em><em>-</em><em>encoding</em><em> genes that play the key role in the colonization and bacterial motility, and it has a significant impact on immunization. This study aimed to design, construct and evaluate the Helicobacter pylori flaA gene expression in eukaryotic cells. </em><em><span dir="RTL"></span></em><br>
<strong><u>Material and Methods</u></strong>: In this experimental study, genomic DNA was purified from the <em>Helicobacter pylori</em> standard strain, and <em>flaA</em> gene was amplified and isolated by PCR method with using the specific primers. Then, this gene was cloned into pTZ vector by T/A cloning technique. <u>To express <em>flaA</em> gene and generate the final construct</u>, the <em>flaA</em> gene was removed from pTZ plasmid and subcloned into the pcDNA3.1 (-) expression vector. The pcDNA3.1 (-)-<em>flaA</em> construct was transformed into CHO cells by electroporation, and <em>flaA</em> eukaryotic gene expression was studied using the SDS-PAGE method.<span dir="RTL"></span><br>
<strong><u>Results</u></strong>: The results showed that <em>flaA</em> gene PCR product was cloned into pTZ vector and amplified in Escherichia coli TOP10F strain. Also, the enzymatic digestion and sequencing showed that the pcDNA3.1 (-)-<em>flaA</em> was performed. Finally, the evaluation of the <em>Helicobacter pyloriflaA</em> gene expression in CHO cells showed that the generated gene construct could express the <em>flaA</em> product in a eukaryotic system, successfully.<br>
<strong><u>Conclusion:</u></strong> Given that the pcDNA3.1 (-)-<em>flaA</em> as a final construct can express the <em>flaA</em> protein of the <em>Helicobacter pylori</em> in animal cells. Flagellin protein is one of the essential antigens of the bacterium So we can appropriately say that gene pcDNA3.1(-)-<em>flaA</em> construct is a suitable candidate for usage in the field of gene vaccines against <em>Helicobacter pylori</em> and it can be used to check the immunization in the laboratory animals in the future research.<br>
<br>
</p>
هلیکوباکتر پیلوری, ژن flaA, کلونسازی, الکتروپوریشن
Helicobacter pylori, flaA gene, Cloning, Electroporation
245
256
http://ismj.bpums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-1&slc_lang=fa&sid=1
Motaram
Sadeghi
محترم
صادقی
5700319475328460010722
5700319475328460010722
No
Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
Abbas
Doosti
عباس
دوستی
abbasdoosti@yahoo.com
5700319475328460010723
5700319475328460010723
Yes
Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران